Generarea trombinei – de la cercetare la practica clinică

Diagnosticul în tromboză şi hemostază are multiple fațete. Cu toate acestea, cele mai multe teste se referă numai la o parte din procesul fiziopatologic. Generarea trombinei este un test global care permite evaluarea ambelor tendințe, atât pro cât și anticoagulante, reflectând balanța hemostatică a pacientului per ansamblu. Ani de zile generarea trombinei a fost considerată un test de cercetare; ulterior au fost dezvoltate aplicații clinice, testul fiind astăzi frecvent folosit în explorarea de rutină. Trombofilia, hemofilia și evaluarea tratamentului cu anticoagulante sunt cele mai obișnuite condiții pentru care generarea trombinei a devenit un test important.

De ce măsurăm trombina:

• localizarea și amplificarea rapidă a proteazelor responsabile de generarea trombinei la locul leziunii alături de inhibarea proteazelor în altă zonă a circulației limitează sângerarea și previne tromboza.
• capacitatea de a genera trombină și activitatea enzimatică a trombinei determină coagulabilitatea sângelui.

Prin urmare, măsurarea potențialului de generare a trombinei și în special a potențialului de lucru enzimatic al trombinei oferă o metodă de cuantificare a efectului compozit al factorilor multipli care determină capacitatea de coagulare și influența mediului asupra acestor factori.

Din punct de vedere clinic ar fi foarte util să existe un test de laborator care să evalueze cu exactitate potențialul de coagulare al unui individ. Un astfel de test ar trebui să identifice stările protrombotice și să se coreleze cu rezultatele clinice, cu sângerările observate clinic în stările congenitale și dobândite de capacitate hemostatică redusă și să indice cantitativ efectul medicamentelor asupra acestei capacități (procoagulante și anticoagulante), indiferent de clasa de medicamente (ex. heparine, inhibitori direcți ai trombinei, antivitamine K sau antiplachetare). ^1,2,3

Hemostaza normală este caracterizată de un echilibru dinamic între componentele procoagulante și cele anticoagulante ale rețelei de coagulare. Acest echilibru și potențialul acestui echilibru de a se schimba ca raspuns la un stimul sunt evaluate în prezent prin măsurarea unuia sau uneori a câtorva factori, și apoi prin estimarea efectului acestor niveluri de factori asupra potențialului întregului sistem pentru a genera trombina.

Cum este generată trombina

Viziunea clasică asupra coagulării sângelui cu cele două căi: intrinsecă și extrinsecă, inițiate de factorul tisular sau de contactul cu o suprafață anionică, nu este un șablon pentru coagularea fiziologică. Se apreciază acum că coagularea nu apare ca o consecință a căilor de activare liniară secvențială a enzimei, ci mai degrabă printr-o rețea de interacțiuni simultane cu reglarea și modularea acestor interacțiuni în timpul procesului de generare a trombinei în sine.

Folosind testul de generare a trombinei în sânge integral, se poate demonstra că după inițierea generării de trombină printr-o concentrație scăzută de factor tisular (TF), există un timp de întârziere pentru generarea de trombină de cel puțin 4 minute și apoi o creștere exponențială a concentrației de trombină⁴. Conversia fibrinogenului la fibrină și formarea cheagului apare când a fost generată mai puțin de 5% din trombina totală.

Măsurarea generării de trombină în laboratorul clinic

La mijlocul anilor 1980, Hemker și colegii săi au dezvoltat testul de generare a trombinei prin introducerea mai multor modificări care au făcut testul mai precis și mai ușor de efectuat⁵. Soluția de fibrinogen a fost înlocuită cu un substrat cromogen și proba de plasmă primară a fost defibrinată.

Mai târziu a avut loc înlocuirea substratului cromogen cu un substrat fluorogenic cu reacție lentă ce a permis măsurarea continuă a generarii de trombină fără a fi nevoie de defibrinare, deoarece semnalul de la fluorofor nu este stins prin turbiditate. În consecință, este de asemenea posibil să se măsoare generarea de trombină în plasma bogată în plachete și să se determine efectul altor elemente celulare.

În trombograma calibrată automată (CAT) are loc monitorizarea divizării unui substrat fluorogenic și compararea acestuia cu o activitare trombinică constantă cunoscută dintr-o probă paralelă ⁶. CAT oferă o metodă reproductibilă care ar putea fi încorporată în practica clinică de laborator.

Utilitatea clinică

Capacitatea unui test de îmbunătățire a rezultatelor pentru sănătate depinde de caracteristicile de performanță ale testului și de caracteristicile clinice ale stării la care este aplicat testul. Un test de generare a trombinei trebuie să dea rezultate reproductibile și să poată detecta un grad variabil de coagulabilitate. Starea investigată trebuie să fie asociată cu o diferență detectabilă a coagulabilității de la normal (variația inter-individuală și variația atribuită bolii) și trebuie să existe o relație între gradul de coagulabilitate și rezultatul clinic.

Diagnostica Stago, înființată în anul 1945 în Franța, este singura companie din industria diagnosticului in-vitro specializată exclusiv în explorările de hemostază și tromboză. În laboratoarele sale de R&D, Stago a dezvoltat metoda de detecție vâscozimetrică, considerată „gold standard” pentru analiza plasmei, punând totodată la dispoziție sisteme performante pentru măsurarea potențialului de generare a trombinei (atât destinate cercetării – trombinoscop CAT, cât și diagnosticului clinic – sistemul ST Genesia, disponibil în curând). În România, produsele Stago sunt distribuite de compania Top Diagnostics.

Bibliografie:

1. Hemker, H. & Beguin, S. (2000) Phenotyping the clotting system. Thrombosis and Haemostasis, 84, 747-751.
2. Mannucci, P. (2002) The measurement of multifactorial thrombo­philia. Thrombosis and Haemostasis, 88, 1—2.
3. Mann, K., Brummel, K. & Butenas, S. (2003) What is all that thrombin for? Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1, 1504—1514.
4. Rand, M., Lock, J., van’t Veer, C, Gafmey, D. & Mann, K. (1996) Blood clotting in minimally altered whole blood. Blood, 88, 3422-3445.
5. Hemker, H.C, Willems, G.M. & Beguin, S. (1986) A computer assisted method to obtain the prothrombin activation velocity in whole plasma independent of thrombin decay processes. Thrombosis and Haemostasis, 56, 9-17.
6. Hemker, H., Giesen, P., Al Dieri, R., Regnault, V., de Smedt, E., Wagenvoord, R., Lecompte, T. & Beguin, S. (2003) Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis, 33, 4-15.